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2022-11-305362 次浏览
核酸提取

核酸提取是指将核酸(DNA和RNA)从细胞中提取出来的过程,总的来说蕴含细胞裂解、核酸纯化及后续核酸浓度、纯度测定的步骤。凭据原始样品的种类和核酸产品后续的各类利用主张,细胞裂解和核酸纯化步骤有分歧的处置步骤和要求。


一、尝试室中的DNA提。

案例一:幼鼠基因型判定尝试的模板DNA提取

初始样品为幼鼠尾切段;蛐团卸ǔ⑹远訢NA模板的浓度、纯度要求不高,消化提取过程相对单一。


尝试步骤:

1.将1cm尾巴切段置于1.5mL微量离心管中,参与适量裂解液(Lysis buffer)和蛋白酶(Proteinase K)于55~65℃水浴过夜消化。

2.充分消化后的尾巴样品参与沉淀液(Precipitation buffer)后用旋涡混匀器来使杂质蛋白充分沉淀,杂质沉淀后通过离心操作(如4℃,4000Xg,5min),取出溶有指标DNA的上清液,抛弃杂质沉淀。

3.上清液中参与100%异丙醇,幼心颠倒离心管30~40次,便能够将产品DNA沉降。离心操作(4℃,10000Xg或12000rpm,10min)去除上清。

4.用75%乙醇洗涤两次DNA产品,待乙醇充分挥发后,用水或TE缓冲液(Tris-EDTA buffer)收成DNA模板产品。


进行后续的PCR扩增尝试前,能够使用Nanodrop仪器来进行DNA浓度和纯度的测定来提高PCR反映的成功率。在PCR扩增尝试不顺利的情况下,也能够进一步对DNA产品的齐全度进行检测,具体步骤能够参查核酸检测和核酸扩增的有关内容。


案例二:用于沉组的质粒DNA提取

用于沉组的质粒对DNA产品的浓度、纯度和齐全度都要求较高,不然无法成功实现质粒酶切和酶连的步骤。


尝试步骤:

1.从含有过夜造就大肠杆菌的试管中取出适量菌液置于微量离心管中,低速离心(4000Xg, 5min)处置后收成大肠杆菌,除去造就液。

2.使用质粒提取试剂盒(Plasmid DNA extraction kit)提取大肠杆菌质粒。道理菌体裂解后,参与中和液(Neutralization buffer)过微型柱,使DNA特异结合于柱上,而其他杂质会过柱洗脱。最后用洗脱液(Elute buffer)洗下DNA即可得到质粒DNA产品。

3.经试剂盒提取后的质粒DNA有时必要经电泳切胶回收的操作将指标质粒DNA与其他DNA分离。切下的胶消化后经DNA纯化试剂盒纯化即可得到纯度较高的指标质粒DNA。具体的内容能够参查核酸检测的有关内容。


二、尝试室中的RNA提取

[ RNA Extraction: Principle, Procedure, Protocol and Importance  – Genetic Education]:

RNA提取过程与DNA类似,也是通过裂解细胞后通过有机溶剂(苯酚、氯仿、异戊醇)沉降杂质的步骤来分离RNA。但RNA的不变性比DNA低好多,因而对RNA提取对温度和传染断根的要求更高。实研操作通常从以下几个角度来提升成功率:降低RNA水解酶活性、提升RNA不变性、使RNA与DNA和蛋白分离、仅沉降RNA、有效去除DNA。


案例一:总RNA提取

尝试步骤与DNA提取类似,但有机溶剂的使用会有所分歧。在初次离心后,混合物会分为三层,RNA溶于上层无色水相,而DNA和蛋白会处于中央层,组织残渣等杂质处于底层酚-氯仿相中2。

尝试步骤:

1.向提取样品中参与裂解液(如Trizol),裂解细胞与组织,室温静置5-8分钟。

2.参与氯仿,充分混匀后离心(4℃,12000rpm,10min),取出上清液。

3.向上清液中参与异丙醇沉降RNA,并离心(4℃,12000rpm,10min)弃去上清。

4.用75%乙醇洗涤产品两次,待乙醇挥发后参与RNase-free水溶化产品。


尝试中用到的J9集团耗材和仪器:

枪头、微量离心管、(15、50mL)离心管、迷你旋涡分离器(105003)。

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