细胞复苏流程
1.从液氮罐中取出冻存细胞，放入37℃水浴锅中消融，柔和离心后网络细胞沉淀；
2.缓慢用移液枪吸去上清，参与适量浓度和体积的齐全造就基，沉悬细胞沉淀，转移至细胞造就皿或细胞造就瓶；
3.凭据细胞造就皿或者造就瓶的体积，补足齐全造就基，放入二氧化碳造就箱中造就观察。
操作中确当苦衷项&幼妙招
① 幼心取出冻存管
很多幼型液氮罐的设计是将细胞冻存在带盖的提篮中，提篮会浸没在液氮中。由于提篮中没有孔格的划分，细胞冻存管无法摆放整齐。取用细胞时辰，尝试人员时时必要逐一查看，寻找打算复苏的细胞，此过程耗时过久，可能会导致其他冻存管内的细胞受损。
通常大型液氮罐会配置成列的冻存架和细胞存储盒，取出冻存架和放回都必要安稳幼心处置，预防带出大量液氮。罐内液氮较多时，可适当在罐口左近停顿，等大部门液氮回流后再拎出。
② 急剧消融待复苏细胞
倒匾到筹备复苏的冻存管后，不要焦急放入水浴锅，先查抄封口膜是否齐全（关于冻存细胞时，是否用封口膜的问题，有经验的呢，城市发现加不加都一样的），若是贴了医用胶布，胶布是否有破损？由于一旦冻存管中有液氮流入，直接放入水浴锅中，管内压力骤升，可能导致冻存管炸裂，危及尝试人员。推荐使用内旋的冻存管，不宜爆炸。若是只有表旋的冻存管，取出后应尽快颠倒/水平搁置数十秒，使得液氮流出。
复苏细胞的主题技术，简而言之就是快融。从液氮罐中取出的细胞，需实时放入37℃水浴锅，进行急剧消融，期间需一向地柔和摇摆冻存管。最好在两分钟内齐全消融细胞。出于卫生思考，有些细胞房没有水浴锅，所以好多复苏操作，必要在分歧尝试室进行。若是两个尝试室距离较远，且尝试室室温较高，可提前筹备一只干净的烧杯，装入37℃的水作中央缓冲。
把稳
? 复苏时不要让水浴锅中的水，流入冻存管中造成传染。
? 复苏过程中要格表注沉无菌操作，经水浴锅消融后，需对冻存管消毒。最好同时更换手套和口罩，全程预防移液器接触管口及管壁。幼妙招：将冻存管放入无菌一次性PE手套中，再放入水中消融，预防传染也方便操作。
③ 柔和网络细胞
网络细胞前，要将所用造就基提前预热并摆放整齐，预防现用现配耽搁复苏过程，实时让刚复苏的细胞接触正常的成长环境。若冻存液中存在DMSO，请凭据所用细胞对其敏感的水平，判断要不要离心弃除。离心主张，一个是去除DMSO，一个是去除死细胞。
刚复苏的细胞状态比力脆弱，应预防屡次奏乐和离心。好比原代细胞在复苏消融后，尽量不要进行离心操作，直接补足造就基，使细胞分散均匀，等3-6幼时，细胞贴壁后，进行换液处置。此方式也合用于其他冻存状态通常的细胞。
④ 造就前，计数&活力检测
复苏过程中，细胞计数必不成少。准则上，冻存前和复苏后，都必要对细胞进行计数和活率分析，判断冻存的成效和细胞复苏后的状态。
2018年9月，美国药典（USP-NF）出台了关于细胞冻存有关政策并明确指出，台盼蓝不能很好地鉴别刚复苏的细胞（细胞的种类和台盼蓝的浓度分歧，对染色了局都有较大的影响），建议使用两种以上的步骤进行细胞计数，如结合荧光染色计数法。
⑤ 支原体或细菌的传染。分离造就物，检测支原体。清洁支架或造就箱。如发现支原体传染，抛弃造就物。建议使用的造就基提前用一次性真空过滤器过滤一下，能有效除去支原体、细菌等，0.1μm的过滤器能够去除支原体，0.22微米去除细菌。
⑥ 复苏的细胞自身状态不好，已经老化，失去贴附性，建议启用新的保种细胞。若是细胞比力宝贵或没有备份细胞，可尝试将不贴壁细胞网络离心，再用 PBS 将沉淀洗濯一遍，离心后的沉淀参与胰酶沉新消化接种，同时提高血清浓度到
15%~20%。
复苏后是否成功，凭据接种后细胞的状态和贴壁率而定，倘若第二天有95%以上的细胞贴壁，且状态优良，则注明复苏成功。复苏接种的时辰，选取较高的接种密度，使细胞的整体密度高一些，有利于细胞的成长。
